最近，知名美妆护肤品牌卷入成分争议风波。有博主质疑称该品牌一款重组胶原蛋白精华的产品涉嫌造假，重组胶原蛋白真实添加量为0.0177%，且未检测出胶原蛋白的核心氨基酸成分——甘氨酸。该公司声明，产品成分标注均按法定标准执行并通过药监部门审核备案，不存在任何成分造假或隐瞒行为。双方争论的核心还在于检测方法的不同。

重组胶原蛋白作为生物医药与护肤领域的高效活性原料，其真蛋白含量直接决定产品的功效与质量，且氨基酸作为基本组成单元构成重组胶原蛋白的链状结构，其特定序列与修饰（如羟脯氨酸）直接决定其三螺旋稳定性及生物学功能。本文使用“凯氏定氮法"检测重组胶原蛋白中的总氮、非蛋白氮及真蛋白含量，并使用“高效液相色谱法"检测重组胶原蛋白中的氨基酸含量，为广大生产企业、第三方检测机构及监管部门提供支持。

根据《YY/T 1947-2025 重组胶原蛋白敷料》中要求，重组胶原蛋白含量可按照《中华人民共和国药典》(2020年版 四部)通则0731蛋白质含量测定法的“凯氏定氮法"进行测定，采用钨酸钠沉降法沉淀样品中的蛋白质，通过差减法减去样品中非蛋白氮含量，从而得到真蛋白含量。

仪器

色色看片在线K1160看片网站下载、SH420F石墨消解仪、分析天平等。

试剂

甲基红、溴甲酚绿、硼酸、氢氧化钠、无水硫酸钾、五水合硫酸铜、浓硫酸、钨酸钠。

样品

重组胶原蛋白修复液。

实验过程

试剂配制完成后，进行样品称量。

样品称量

1、总氮含量测试：通过减量法准确称取样品5 g左右（精确至0.1 mg），并转移至洁净的消化管中。

2、非蛋白氮含量测试：通过减量法准确称取样品5 g左右（精确至0.1 mg），置于20 mL容量瓶中，加入10 mL的纯水、2 mL的10%钨酸钠溶液和2 mL的0.33 mol/L硫酸溶液，加水定容至刻度。摇匀，静置30分钟后，于3000 rpm下离心5 min以促进样品过滤。随后取上清液进行过滤，弃去初滤液（约5滴），取续滤液，使用10 mL移液管准确量取10 mL滤液于消化管中待测。空白消化管中则需加入8 mL的纯水、1 mL的10%钨酸钠溶液和1 mL的0.33 mo1/L硫酸溶液。

消解

向空白及样品消化管中加入0.2 g硫酸铜、3 g硫酸钾和10 mL浓硫酸后上机消解。消解程序如表1：

表1  SH420F石墨消解仪消解程序设置

蒸馏与滴定

待消解程序完成，消化管冷却并无酸雾后，使用凯氏定氮仪进行检测，定氮仪参数设置如表2：

表2  K1160看片网站下载试验参数设置

测试结果

样品经消解和上机测试，重组胶原蛋白产品中总氮、非蛋白氮及真蛋白含量如表3至表5所示：

表3  样品中总氮含量表

表4  样品中非蛋白氮含量表

表5  样品中真蛋白含量表

注：表中真蛋白含量=（样品总氮含量-非蛋白氮含量）×蛋白转换系数（5.07）。

结论

经测试，重组胶原蛋白产品中的总氮、非蛋白氮和真蛋白含量分别为0.3348 mg/g、0.1118 mg/g和1.1306 mg/g。实验结果表明，凯氏定氮仪可用于检测重组胶原蛋白产品中的真蛋白含量。

高效液相色谱法检测氨基酸时，因氨基酸自身无紫外吸收基团，需借助异硫氰酸苯酯（PITC）、邻苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNSCl）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）等柱前衍生试剂引入生色基团，使衍生物具备紫外吸收特性以便被检测。异硫氰苯酯（PITC）作为氨基酸分析中的经典柱前衍生试剂，通过与氨基酸的α-氨基特异性反应生成稳定的苯基硫代氨基甲酰（PTC）衍生物，该衍生物具有强紫外吸收特性（λmax=254nm），可显著提升检测灵敏度至皮摩尔级，同时其反应条件温和、产物稳定性高且能兼容多数氨基酸（包括含羟基或含硫氨基酸），使其在高效液相色谱分析中成为兼顾灵敏度、选择性与操作便捷性的理想选择。本实验采用PITC柱前衍生-高效液相色谱法检测重组胶原蛋白中的16种氨基酸。

仪器配置

悟空K2025高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站。

色谱条件：

色谱柱：JinGuBang AAA ，4.6×250 mm，5 μm；

流动相：流动相A为0.05 mol/L乙酸钠水溶液，流动相B为甲醇-乙腈-水=1:3:1，梯度洗脱如下表：

进样量：20 μL；

洗针液：90%甲醇水溶液；

柱温：40℃；

检测器及检测波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为254 nm。

实验结果

1、线性范围结果

按照色谱条件进行采集，16种氨基酸混合标准溶液的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

图1  16种氨基酸混合标准溶液的色谱图

胶原蛋白含量的检测方法多样，具体选择取决于样本类型、设备条件等，可根据实验室条件和需求选择合适方法，必要时可结合多种技术验证结果。